Complément alimentaire – La consommation chronique d’alcool modifie la géométrie de l’espace extracellulaire et la diffusion de l’émetteur dans le cerveau


Abstrait

Une consommation d’alcool déjà modérée a des effets néfastes à long terme sur la fonction cérébrale. Cependant, la façon dont l’alcool produit ses puissants effets de dépendance en dépit d’être un faible renforçateur est une énigme mal comprise qui entrave probablement le développement d’interventions réussies pour limiter la consommation excessive d’alcool. Dans cette étude translationnelle, nous démontrons une diffusivité moyenne accrue généralisée dans la matière grise du cerveau des humains et des rats qui boivent de manière chronique. Ces altérations apparaissent peu après l’initiation à la consommation chez le rat, persistent jusqu’à l’abstinence précoce chez les deux espèces et sont associées à une forte diminution de la tortuosité de l’espace extracellulaire expliquée par une réaction microgliale. La modélisation mathématique des changements de diffusivité révèle une portée spatiale accrue des émetteurs à libération extrasynaptique comme la dopamine qui peuvent contribuer à la puissance addictive progressivement améliorée de l’alcool.

INTRODUCTION

Les boissons alcoolisées sont l’un des produits les plus importants, avec près de 2 milliards de consommateurs dans le monde. D’un autre côté, la consommation d’alcool représente une part substantielle du fardeau sanitaire mondial. Dans les pays industrialisés, environ 10% des années de vie corrigées de l’incapacité sont dues à la consommation d’alcool (1). Des études récentes montrent que même une consommation d’alcool très modérée en dessous des nouvelles directives plus strictes en matière d’alcool au Royaume-Uni ne prévient pas les effets indésirables à long terme de l’alcool sur les fonctions cérébrales (2). L’alcool a une forte capacité à induire des neuroadaptations qui favorisent sa saillance incitative, la formation de fortes habitudes de consommation et des comportements addictifs, conduisant souvent au développement d’un trouble de la consommation d’alcool (AUD). Comment l’alcool produit ses puissants effets addictifs en dépit d’être un faible renforçateur est une énigme qui est mal comprise et qui entrave probablement le développement d’interventions réussies pour limiter la consommation excessive d’alcool.

L’imagerie par résonance magnétique (IRM) du tenseur de diffusion, en mesurant la diffusion de l’eau dans le parenchyme cérébral, est capable de détecter des anomalies microstructurales du cerveau suite à une consommation excessive d’alcool avant même l’apparition de changements macrostructuraux (c’est-à-dire volumétriques) (3). Notre groupe a récemment utilisé l’imagerie par tenseur de diffusion (DTI) pour démontrer des preuves convergentes d’altérations de la substance blanche chez les humains avec des rats AUD et exposés à l’alcool (4). Bien que le DTI soit le plus couramment utilisé dans l’étude de la matière blanche, il peut également être appliqué à l’étude de la matière grise du cerveau. En utilisant un modèle établi de rongeurs de consommation excessive d’alcool, les rats Marchigian-Sarde préférant l’alcool (MSP) (5), une étude récente a suggéré que la diffusivité moyenne (DM) mesurée par DTI dans l’ensemble du cerveau est le paramètre le plus pertinent pour caractériser les états induits par l’alcool (6). Aucune étude DTI n’a caractérisé la DM chez les alcooliques humains. MD mesure le déplacement moyen des molécules d’eau dans le tissu et, à faible pondération de diffusion, reflète particulièrement la dynamique de l’eau extracellulaire. Les altérations de la DM ont été associées à des processus neuroinflammatoires à la fois théoriquement (4) et expérimentalement, à l’aide de marqueurs histologiques (7). Notamment, la neuroinflammation a été proposée comme mécanisme des lésions cérébrales liées à l’alcool (8). Cependant, les paramètres de diffusion du DTI, bien que sensibles aux changements de la géométrie de l’espace extracellulaire (ECS), n’ont pas la spécificité nécessaire pour mesurer des caractéristiques spécifiques comme la tortuosité et la fraction volumique extracellulaire (9), nécessaire pour décrire la diffusion des neurotransmetteurs dans le SEC. Au lieu de cela, ces paramètres peuvent être mesurés à partir de méthodes invasives directes telles que l’iontophorèse en temps réel, un paradigme de source ponctuelle qui utilise le tétraméthylammonium comme petit marqueur moléculaire inerte (dix12).

Le fait que l’alcool puisse modifier la diffusion dans la matière grise ECS semble important pour les effets pharmacodynamiques de l’alcool, car ses effets gratifiants, qui varient fortement le long de la trajectoire de l’AUD, sont connus pour être médiés par le glutamate, la monoamine et les neurotransmetteurs peptidiques (1315). Ces neuromodulateurs agissent en partie via des récepteurs situés de manière extrasynaptique qui sont atteints via une diffusion à longue distance à travers l’ECS, constituant un mécanisme de signalisation de type hormonal dans le cerveau, également appelé transmission de volume (16). Une altération de l’ECS devrait donc affecter la dynamique de ces neurotransmetteurs. À notre connaissance, la possibilité que la consommation chronique d’alcool puisse affecter la plage de diffusion des neurotransmetteurs libérés localement tels que la dopamine n’a pas été envisagée jusqu’à présent.

Ici, nous utilisons une stratégie expérimentale à plusieurs niveaux, y compris (i) DTI non invasive chez les rats msP avant, pendant et après la consommation d’alcool, ainsi que chez les patients avec AUD et témoins sains; (ii) iontophorèse invasive in vivo en temps réel dans la matière grise de rats msP alcooliques chroniques et naïfs; (iii) évaluation post-mortem des protéines de la matrice extracellulaire et des marqueurs gliaux par immunohistochimie quantitative; (iv) interférence directe avec le pool microglial chez les rats pour démontrer leur suffisance dans les phénomènes DTI observés; et (v) une approche numérique pour résoudre l’équation de diffusion de la dopamine dans un SEC sain et exposé à l’alcool. Nos résultats combinés indiquent une diffusivité accrue généralisée dans la matière grise des animaux buvant de l’alcool et des patients atteints de AUD, qui persiste jusqu’à l’abstinence précoce. Chez le rat, cette augmentation de la matière grise DM s’accompagne de la réduction de la tortuosité de l’ECS et est liée à une réaction microgliale. Modélisation de la diffusivité de la dopamine dans l’ECS (17), nous montrons que la consommation chronique d’alcool augmente les concentrations de neurotransmetteurs avec le temps. Par conséquent, nous pensons que l’augmentation de la diffusivité dans le SEC pourrait être un nouveau mécanisme de dépendance à l’alcool en potentialisant les effets considérables de la dopamine.

RÉSULTATS

La consommation chronique d’éthanol augmente la DM dans le parenchyme cérébral chez le rat et l’homme

Nous avons comparé la DM au voxel chez des rats avant et après 4 semaines de consommation d’alcool et de témoins non buvant dans un modèle 2 × 2 intra-sujet. Pendant cette période, la consommation d’alcool est passée de 3 à 4 g kg−1 journée−1 dans les 5 premiers jours à 7 à 8 g kg−1 journée−1 à partir du 10e jour (la consommation quotidienne individuelle d’EtOH est indiquée sur la figure 1E). Ces niveaux de consommation d’alcool entraînent des taux d’alcoolémie (BAL) pharmacologiquement pertinents pouvant atteindre 1 g / litre chez les rats msP (5). Chez l’homme, ces BAL sont généralement atteints après la consommation de quatre verres standard en 1 heure, ce qui est une dose légalement enivrante. Dans ces conditions, nous avons observé une augmentation de MD à l’échelle du cerveau induite par l’alcool dans la matière grise (Fig. 1A). L’analyse par régions d’intérêt (ROI) a confirmé le changement de DM (figure 1B et tableau S1). Nous avons trouvé un effet d’interaction groupe × temps significatif (P <10−3) dans toutes les régions anatomiques évaluées (tableau S1). Dans quatre des six ROI, nous avons observé une diminution de la DM due à l’effet de l’âge (réduction de 3 ± 0,9%), cohérente avec la diminution de la diffusivité de l’eau dans le cerveau avec l’âge (18), qui contrastait avec l’augmentation globale de la DM induite par l’alcool (augmentation de 5 ± 0,3%) observée dans toutes les ROI dans le même intervalle de temps (Fig. 1B).

Fig. 1 Effets de la consommation d’alcool dans le DM pour les rats et les humains.

(UNE) Analyse statistique par voxel montrant les différences longitudinales de DM entre les rats au départ et après 4 semaines de consommation d’alcool. (B) Changement de DM moyen par rapport à la valeur de base dans six régions de matière grise d’intérêt (ROI) pour les rats msP buvant de l’alcool et témoins. Les statistiques post hoc rapportées montrent des différences significatives entre l’alcool et la ligne de base, ainsi qu’un effet d’âge significatif dans le groupe témoin. (C) Analyse statistique par Voxel montrant les différences transversales de DM entre les témoins et les patients alcoolodépendants lors du premier examen. () Valeurs MD moyennes dans les ROI sélectionnées pour les contrôles et les patients avec AUD au premier balayage. Les statistiques rapportées montrent des différences transversales entre les témoins et les patients atteints de AUD. Pour tous les panneaux, *P <0,05, **P <0,01 et ***P <0,001. (E) Préférence individuelle d’EtOH, mesurée comme le rapport d’EtOH / quantité d’eau potable, représentée en fonction du jour d’exposition (de 1 à 28 jours) dans un lot d’animaux représentatifs. Cg, cortex cingulaire; I, cortex insulaire; S1, cortex somatosensoriel primaire; Hc, hippocampe; Acb, accumbens; CPu, caudé-putamen.

Chez l’homme, nous avons trouvé un schéma de changements similaires à ceux observés chez le rat. Une augmentation généralisée de DM est observée dans des conditions d’alcool par rapport aux témoins (Fig. 1C) dans l’analyse par voxel. L’analyse du retour sur investissement a confirmé qu’il y avait une augmentation globale significative de MD pour AUD par rapport aux témoins[[F(11 891) = 8,7, P <0,001 et une taille d'effet moyenne de 8,4%]. Alors que plus de patients avec AUD étaient des fumeurs par rapport aux témoins, à la lumière de la similitude entre les données sur les rats et les humains, la différence de tabagisme n'est pas susceptible d'expliquer les différences observées de DM. En outre, la cohorte AUD était légèrement plus âgée que les témoins. Bien que cela ait été pris en compte dans les statistiques, nous avons répété l'analyse dans un sous-ensemble de sujets appariés selon l'âge (fig. S1), ne trouvant aucune différence avec l'analyse effectuée dans la cohorte complète. Pour des statistiques détaillées et des descripteurs cliniques, voir respectivement les tableaux S2 et 1. Nous n'avons trouvé aucune différence entre les stades d'alcool et d'abstinence chez les deux espèces[[F(1,8) = 1,4, P = 0,269 pour les rats; F(1,49) = 0,9, P = 0,349 pour les humains; voir fig. S2, A et B].

Tableau 1 Données démographiques et cliniques pour les témoins et les patients sains.

ADS, échelle de dépendance à l’alcool; FTND, test Fagerstroem pour la dépendance à la nicotine.

La consommation chronique d’éthanol diminue la tortuosité dans le compartiment extracellulaire

Alors que MD fournit des mesures à l’échelle du cerveau de la vitesse de diffusion de l’eau dans le tissu, la contribution des différents compartiments (c.-à-d. Intracellulaire par rapport à extracellulaire) à cette mesure ne peut pas être démêlée. Pour tester notre hypothèse selon laquelle l’alcool peut augmenter la diffusivité des neurotransmetteurs libérés dans l’ECS, nous sommes passés à des expériences d’iontophorèse en temps réel. Avec cette technique, les propriétés de l’ECS peuvent être mesurées avec précision (dix). Plus précisément, en utilisant deux groupes d’animaux, buvant de l’alcool et naïfs (n = 12, Fig.2A), et en mesurant la diffusion dans le cortex d’un composé traceur[lecationtétraméthylammonium(TMA[thetetramethylammoniumcation(TMA+)]injecté dans l’ECS par une impulsion de courant (Fig. 2B), nous avons calculé le volume occupé par l’ECS ou la fraction volumique d’ECS (α) et la tortuosité du facteur géométrique (λ; Fig. 2, D à E). Profils de temps de concentration représentatifs en réponse à une impulsion iontophorétique (TMA+ courbes de diffusion) sont montrées sur la figure 2C. Parce qu’aucune différence significative entre les couches corticales n’a été trouvée non plus pour α[[F(3,38) = 1,06, P = 0,36; interaction, F(3,38) = 0,34, P = 0.80]ni valeurs λ[[F(3,38) = 0,8, P = 0,48; interaction, F(3,38) = 0,2, P = 0,92], les données des différentes couches ont été regroupées pour l’analyse statistique. Nous avons constaté que la consommation d’alcool pendant un mois induisait des changements significatifs dans les propriétés de l’ECS (Fig. 2, D et E). Une diminution marginalement significative de la fraction volumique du SCE cortical[témoin0196±0007;EtOH0176±0004;[control0196±0007;EtOH0176±0004;F(1,38) = 6,7, P <0,05]et une diminution fortement significative de la tortuosité[contrôle1503±0015;EtOH1403±0015;[control1503±0015;EtOH1403±0015;F(1,38) = 21,6, P <0,0001]ont été trouvés dans le groupe de consommation d'alcool. Ces résultats sont cohérents avec un effet de l'alcool sur l'ECS qui augmente la DM en éliminant les barrières à la diffusion. Dans l'ensemble, les fortes réductions de la tortuosité, ainsi que la légère réduction de la fraction volumique de l'ECS, soutiennent l'hypothèse d'une augmentation induite par l'alcool de l'efficacité de la transmission volumique. Les neurotransmetteurs libérés seront moins dilués et atteindront plus loin dans le SEC (voir ci-dessous).

Fig. 2 L’alcool modifie la géométrie ECS.

(UNE) Conception expérimentale. (B) Schéma illustrant la disposition des électrodes dans une expérience typique. (C) Courbes de diffusion représentatives et leurs paramètres obtenus in vivo dans la couche corticale V d’un témoin et d’un rat exposé à l’alcool ou dans la gélose diluée. () Quantification de la fraction volumique (α) chez les rats msP témoins (blancs) et exposés à l’alcool (noirs). Un effet légèrement significatif de l’alcool a été trouvé par ANOVA bidirectionnel[[F(1,38) = 6,7, P <0,05]. Aucun effet de couche corticale ou d'interaction entre le traitement à l'alcool et la couche corticale n'a été trouvé. (E) Quantification de la tortuosité (λ) chez les rats msP témoins (blancs) et exposés à l’alcool (noirs). Un effet significatif et robuste de l’alcool a été trouvé par ANOVA bidirectionnel[[F(1,38) = 21,6, P <0,0001]. Aucun effet de couche corticale ou d'interaction n'a été trouvé. Pour tous les panneaux, *P <0,05 et ***P <0,001.

Régulation à la baisse des marqueurs microgliaux après une consommation chronique d’éthanol

Nous avons ensuite recherché des corrélats histologiques des changements des paramètres de diffusion de l’ECS. Les changements typiques du parenchyme cérébral affectant la fraction volumique et la tortuosité de l’ECS comprennent la perte ou la prolifération cellulaire, les réactions des cellules gliales (microglie et astrocytes) et les changements dans la composition de la matrice extracellulaire (19). En conséquence, nous avons immunocoloré et quantifié l’intensité de coloration des astrocytes [glial fibrillary acidic protein (GFAP)], microglie (Iba-1) et protéoglycane de sulfate de chondroïtine (CSPG); compté le nombre des deux types de cellules gliales; et analysé en outre la morphologie des astrocytes et des cellules microgliales dans des coupes histologiques obtenues à partir de deux groupes d’animaux msP, avant et après 1 mois de consommation d’alcool (Fig. 3A). Sachant que les changements de DM induits par la consommation d’alcool persistent dans l’abstinence, nous avons inclus un troisième groupe de rats msP dans lequel 1 semaine d’abstinence a été forcée après la période de consommation (fig. S2, C et D). Nous avons concentré l’analyse sur tous les ROI utilisés dans l’analyse IRM, lorsque cela était possible. De tous les marqueurs histologiques mentionnés ci-dessus, les cellules microgliales ont montré la plus forte réponse induite par l’alcool (Fig. 3B). L’intensité de coloration CSPG n’a démontré aucun changement significatif entre les conditions expérimentales[analysebidirectionnelledelavariance(ANOVA);[two-wayanalysisofvariance(ANOVA);F(1,68) = 0,19, P = 0,67; figure. S3], comme ce fut le cas pour le nombre d’astrocytes[ANOVAbidirectionnelle;[two-wayANOVA;F(1 110) = 2,2, P = 0,14; figure. S3]et leur volume[ANOVAbidirectionnelle;[two-wayANOVA;F(1 110) = 0,54, P = 0,46; figure. S3]. Cependant, pour la coloration Iba-1, nous avons trouvé une forte diminution induite par l’alcool du nombre de cellules microgliales[Figure3C;ANOVAbidirectionnelle;[Fig3C;two-wayANOVA;F(1,40) = 97,7, P <0,0001]et intensité de coloration après 1 mois de consommation d'alcool[Figure3D;ANOVAbidirectionnelle;[Fig3D;two-wayANOVA;F(1,34) = 34,2, P <0,0001]. Pendant la période d'abstinence, le nombre de cellules microgliales récupéré partiellement (fig. S2C), mais pas l'intensité de coloration (fig. S2D). La reconstruction morphologique des cellules microgliales dans différentes conditions a montré une diminution significative du volume de filament par ROI dans le noyau accumbens et l'hippocampe (Fig.3, E à H; non apparié t tester, t = 6,1, df = 5, P = 0,0017; non apparié t tester, t = 14,8, df = 3, P = 0,0007, respectivement), qui ne s’inverse pas dans des conditions d’abstinence (non apparié t tester, t = 1,454, df = 8, P = 0,1840; non apparié t tester, t = 0,3288, df = 4, P = 0,75, respectivement). Nous avons analysé en outre la viabilité des cellules neuronales en comptant le nombre de neurones (NeuN) et l’intensité de coloration (NeuN et neurofilament; fig. S3).

Fig. 3 Réponse microgliale à la consommation d’alcool.

(UNE) Conception expérimentale. IHC, immunohistochimie. (B) Immunocoloration Iba-1 – positive (Iba-1 +) dans des coupes histologiques provenant d’animaux représentatifs des deux groupes expérimentaux. Des images ont été prises à partir de la formation hippocampique (gyrus denté). (C) Quantification du nombre de cellules Iba-1 + dans des conditions de contrôle (blanc) et après 1 mois de consommation (noir). Un effet significatif robuste du groupe expérimental a été trouvé par ANOVA bidirectionnel[[F(1,40) = 97,7, P <0,0001]et une interaction significative entre les facteurs[[F(5,40) = 3,5, P = 0,01]. () Identique à (C) mais pour l’intensité de la coloration. Un effet significatif robuste du groupe expérimental a été trouvé par ANOVA bidirectionnel[[F(1,34) = 34,2, P <0,0001]. Aucune interaction n'a été trouvée[[F(5,34) = 1,11, P = 0,38]. (E) Analyse morphologique de 56 cellules de microglie dans le noyau accumbens, montrant un volume de filament réduit par ROI dans des conditions EtOH (non apparié t tester, t = 6,1, df = 5, P = 0,0017). (F) Exemple de cellules de microglie reconstruites dans les deux conditions dans le noyau accumbens. (g) Analyse morphologique de 56 cellules de microglies dans l’hippocampe, montrant un volume de filament réduit par ROI dans des conditions EtOH (non apparié t tester, t = 14,8, df = 3, P = 0,0007). (H) Exemple de cellules de microglie reconstruites dans les deux conditions dans l’hippocampe. Pour tous les panneaux, *P <0,05, **P <0,01 et ***P <0,001.

Dans l’ensemble, le résultat histologique quantitatif est en accord avec les changements de tortuosité cérébrale MD et ECS dans notre modèle de consommation modérée d’alcool. Pour les propriétés ECS, une réduction du nombre de cellules microgliales et des ramifications dans le tissu signifie une réduction des barrières de diffusion, ce qui est cohérent avec une diminution de la tortuosité ECS et une augmentation de DM. Nous avons ensuite testé si la population microgliale pouvait expliquer l’ampleur observée du changement de DM.

La réduction du contenu microglial ou de la complexité de la matière grise améliore la DM

Pour démontrer la suffisance de la réponse microgliale pour provoquer l’augmentation observée de DM par l’alcool, nous avons réduit la densité des processus de microglie dans la matière grise par deux approches alternatives. Tout d’abord, nous avons utilisé l’inhibiteur sélectif du récepteur du facteur 1 stimulant les colonies (CSF1R) PLX5622 (Plexxikon Inc.), qui entraîne une réduction étendue et spécifique du nombre et de la complexité des cellules microgliales (20). Comme prévu, l’administration systémique de PLX5622 (7 jours; voir Matériel et méthodes) a considérablement réduit la population de cellules microgliales dans le cerveau (Fig. 4, D et F). La déplétion microgliale était associée à une augmentation significative de la DM, telle que mesurée par le DTI[[F(1,8) = 6,3, P = 0,03; Fig. 4G].

Fig. 4 MD augmente après des interventions dirigées contre la microglie.

(UNE et B) Modèles expérimentaux pour PLX5622 et lipopolysaccharide (LPS), respectivement. (C) Coloration Iba-1 représentative dans l’hippocampe d’un rat témoin. () Coloration Iba-1 représentative dans l’hippocampe après 7 jours d’administration de PLX5622. (E) Coloration Iba-1 représentative d’un hippocampe injecté au LPS 24 heures après la chirurgie. (F) Quantification de la densité des processus microgliaux pour les rats témoins et PLX5622 (non apparié t tester, t = 7,6, df = 467, P <0,0001). (g) DM mesuré dans six ROI de matière grise pour les rats témoins et les rats traités avec PLX5622. F(1,8) = 6,3, P = 0,03. (H) Réduction de la densité des processus microgliaux dans l’hémisphère injecté par LPS par rapport au contrôle (non apparié t tester, t = 69,11, df = 237, P <0,0001). (je) Augmenter la DM dans l’hémisphère injecté par LPS par rapport au contrôle (apparié t tester, t = 3,7, df = 6, P = 0,009). *P <0,05, **P <0,01 et ***P <0,001. Cg, cortex cingulaire; I, cortex insulaire; S1, cortex somatosensoriel primaire; Hc, hippocampe; Acb, accumbens; CPu, caudé-putamen.

Dans une seconde expérience, nous avons induit une réaction microgliale focale en injectant du lipopolysaccharide (LPS), une endotoxine composée de composants de la paroi cellulaire de bactéries, connue pour provoquer une activation robuste de la microglie caractérisée par un épaississement des corps cellulaires et une forte réduction de ses ramifications , entraînant une diminution de la complexité (21). L’injection stéréotaxique de LPS dans un hémisphère hippocampique, avec la solution saline controlatérale recevant une solution saline et servant de contrôle intra-animal, a produit la modification attendue de la morphologie de la microglie (Fig.4H) et une augmentation significative de la DM sélectivement dans l’hémisphère injecté par LPS[[t(6) = 3,7, par paire, P <0,01; Fig. 4I].

Dans les deux expériences, la réduction des marqueurs microgliaux était liée à une augmentation de la DM d’une ampleur comparable, telle qu’observée après une exposition chronique à l’alcool (alcool, 5,6%; PLX5622, 6,5%; LPS, 4,9% par rapport aux témoins respectifs).

Modélisation de la diffusion de la dopamine pour différentes géométries ECS

Nous avons ensuite résolu numériquement l’équation de diffusion pour les deux géométries ECS décrites dans nos expériences, une pour les conditions d’alcool et une pour le contrôle, selon la formule rapportée par Nicholson (17). Cette équation prend également en compte l’absorption de dopamine par le transporteur de dopamine (DAT), caractérisée par une vitesse maximale (Vm) et une constante de Michaelis-Menten (voir Matériels et méthodes). Comme prévu, les altérations trouvées dans la tortuosité et la fraction volumique ECS ont eu un impact sur la dynamique spatiale et temporelle de la concentration de dopamine (Fig. 5). Nous avons mis en œuvre deux modes de libération de dopamine, tonique et phasique. Pour les deux modèles de libération de dopamine, la dopamine était, en moyenne, plus disponible dans le SEC des sujets exposés à l’alcool par rapport aux témoins, en particulier à des temps plus courts et intermédiaires. Bien que les preuves ne soient pas solides d’une étude à l’autre, il y avait des indications antérieures selon lesquelles l’alcool pourrait interférer avec la cinétique DAT (22). Alors que Budygin et coll. (23) ont trouvé des effets de l’alcool sur DAT Vm, d’autres ne l’ont pas trouvé (24) ou trouvé des résultats mitigés (25). Néanmoins, nous avons décidé d’envisager cette possibilité en utilisant une large gamme de valeurs Vm, couvrant celles trouvées dans la littérature ci-dessus (Vm = −60 à 30%, +30 et + 60% par rapport à la valeur de base). Les résultats présentés sur la fig. S4 a démontré que nos résultats sur l’évolution spatio-temporelle de la concentration de dopamine étaient robustes sur toute la gamme des valeurs de Vm testées.

Fig. 5 Concentration de dopamine dans l’espace et le temps pour l’alcool et les conditions de contrôle.

(UNE) Modèle de libération de dopamine tonique (plat). (B) Différence entre les concentrations de dopamine dans EtOH et les conditions de contrôle dans la plage de 1 à 100 μm et de 0 à 3 s. Le jaune indique le contrôle EtOH> et le bleu foncé indique le contrôle> EtOH. (C) Concentration totale (tot) intégrée sur tout l’espace, pour chaque temps et pour les deux conditions. () Concentration totale intégrée à travers tous les temps, pour chaque position spatiale et pour les deux conditions. (E) Modèle de libération de dopamine phasique normalisé (salve de 4 ms de largeur et fréquence de 20 Hz). (F) Différence entre les concentrations de dopamine dans EtOH et les conditions de contrôle dans la plage de 1 à 100 μm et de 0 à 3 s. Le jaune indique le contrôle EtOH> et le bleu foncé indique le contrôle> EtOH. (g) Concentration totale intégrée sur tout l’espace, pour chaque temps et pour les deux conditions. (H) Concentration totale intégrée à travers tous les temps, pour chaque position spatiale et pour les deux conditions.

DISCUSSION

Dans ce travail, nous avons utilisé les propriétés de diffusion pour caractériser la microstructure de la matière grise du cerveau en AUD. En utilisant une DTI non invasive à la fois chez des rats buvant de l’alcool et des patients atteints de TDA, nous avons signalé des schémas remarquablement similaires d’augmentation de la DM par l’alcool, qui persistent jusqu’à une abstinence précoce. Nous avons ensuite étudié le mécanisme sous-jacent à cette observation IRM translationnelle et avons trouvé une diminution significative de la tortuosité de l’ECS, qui pourrait être expliquée par une réaction microgliale dans des conditions alcooliques. Nous avons étudié comment la géométrie modifiée de l’ECS affecte la dynamique de diffusion des neurotransmetteurs libérés et la proposons dans le cadre du mécanisme soutenant le puissant effet addictif de l’alcool.

La première découverte clé de cette étude est le schéma particulièrement similaire d’augmentation de la DM dans le parenchyme cérébral des alcooliques humains et des rats buveurs d’alcool. Dans une récente expérience de classification utilisant l’imagerie cérébrale multimodale pour séparer les différentes étapes chez les rats msP exposés à l’alcool, nous avons identifié la MD comme une caractéristique importante qui contribue à la haute performance du classificateur d’apprentissage automatique (6). La nouvelle découverte, chez les patients humains, renforce la pertinence de la matière grise DM en tant que propriété microstructurale importante affectée par l’AUD et met en évidence la valeur du DTI appliqué à la matière grise, en plus de la substance blanche, comme cela est couramment fait, comme source de biomarqueurs d’imagerie . Une étude antérieure portant sur la mémoire épisodique verbale chez les alcooliques humains a également rapporté une association entre l’augmentation du coefficient de diffusion apparent (c’est-à-dire la diffusivité dans une direction) dans le lobe frontal et temporal des patients alcooliques, mais pas le volume, avec une diminution des performances de la mémoire (26). À notre connaissance, les changements de DM dans la matière grise des alcooliques n’ont pas été étudiés jusqu’à présent. Des résultats convergents dans les deux espèces ont été trouvés dans notre étude, sans tenir compte des facteurs de confusion dans la population humaine, tels que la co-abus ou les comorbidités, absents dans le modèle animal contrôlé. De plus, la trajectoire à long terme de l’AUD humain, généralement plus de 10 ans, peut ne pas être nécessaire pour développer une augmentation de la DM car 1 mois de consommation d’alcool chez le rat suffit à induire le phénomène, suggérant sa contribution aux premiers processus sous-jacents au cerveau induit par l’alcool. transformations. La validité de la traduction de ce modèle animal a été largement validée par des preuves comportementales, moléculaires et fonctionnelles (4, 5). Cette nouvelle découverte complète les observations récentes dans la substance blanche de patients alcooliques et de rats, dans lesquels des altérations convergentes de DTI ont été trouvées dans les deux espèces (4), et souligne le rôle important que les tests sur animaux peuvent jouer pour surmonter la crise translationnelle de la recherche psychiatrique.

Alors que le DTI fournit des indicateurs non invasifs facilement accessibles d’anomalies tissulaires, l’interprétation des résultats observés en termes de substrat cellulaire sous-jacent aux changements est difficile, car plusieurs processus biologiques peuvent provoquer des changements similaires dans les propriétés de diffusion, en particulier dans la matière grise (2728). Par conséquent, MD reflète la diffusion moyenne de tous les compartiments présents dans le voxel d’imagerie et ne permet pas une différenciation précise entre les compartiments cellulaires et extracellulaires. Ainsi, en utilisant l’iontophorèse en temps réel, nous nous sommes spécifiquement concentrés sur la géométrie de l’ECS. Nos résultats, démontrant une diminution de la tortuosité de l’ECS chez les rats buvant de l’alcool, ont fourni le substrat physique pour l’augmentation observée de DM chez les deux espèces. Nous sommes allés plus loin pour soutenir les résultats de l’IRM et de l’iontophorèse en temps réel avec une analyse histologique chez le rat et avons trouvé une forte association entre la microglie et l’augmentation de la diffusivité tissulaire. La consommation d’alcool a induit une réduction du nombre de cellules microgliales et de leur complexité, mesurée comme le modèle de ramification de leurs processus. Nous démontrons que les deux réductions de la complexité de la microglie ou le nombre de cellules génèrent par lui-même une augmentation robuste de la matière grise MD, soutenant la capacité des altérations de la microglie à provoquer les changements observés MD dans l’AUD. Les résultats sont résumés sur la fig. S5. En bon accord, plusieurs études chez les alcooliques humains post-mortem (2931) et les rats (32) ont trouvé une réduction de la densité gliale, bien que certaines études aient rapporté une expression accrue du marqueur microglie Iba-1 dans le cerveau d’individus alcooliques et de rats[récemmentexaminédans([recentlyreviewedin(8)]. Notamment, la neuroinflammation a été proposée comme mécanisme des lésions cérébrales liées à l’alcool (33), par exemple, via la modulation épigénétique de l’expression génique spécifique de la microglie (3435) et les cellules microgliales pour être des régulateurs critiques des réponses alcooliques dans le cerveau (36). Les manipulations pharmacologiques de cellules microgliales chez des rats témoins par ailleurs, en utilisant LPS ou PLX, ont généré une augmentation de DM d’une ampleur comparable à celle induite par l’exposition à l’alcool. L’administration de LPS a été associée à une augmentation de la consommation d’alcool chez les rongeurs (37).

Les altérations de l’IMT de la substance blanche chez les patients alcooliques évoluent vers l’abstinence4). Cette découverte inattendue a été interprétée comme une indication d’un processus sous-jacent déclenché par l’alcool qui progresse après l’arrêt de la consommation d’alcool. En revanche, la matière grise ne montre aucune progression détectable du signal DTI au cours de l’abstinence précoce. Ceci est corroboré par notre analyse immunohistochimique chez le rat qui a démontré une expression réduite d’Iba-1 pendant au moins 1 semaine après l’arrêt de l’alcool. Les réponses différentielles de la glie dans les matières grises et blanches apparaissent comme des facteurs importants dans la pathologie de l’AUD, en particulier dans la phase précoce d’abstinence, lorsque les patients sont très vulnérables aux rechutes et que des décisions sur les choix de traitement optimaux doivent être prises. Une fois que la réponse de la microglie liée à l’alcool est comprise et peut être interférée, le DTI peut fournir des biomarqueurs facilement accessibles pour la détection de signes d’alerte précoce ou pour guider des thérapies individualisées.

Nous avons profité d’équations de diffusion bien développées pour la neurotransmission dopaminergique (17) pour tester théoriquement l’impact des changements mesurés expérimentalement dans l’ECS sur la concentration de dopamine extracellulaire dans le temps et dans l’espace. Ces calculs analytiques soutiennent l’hypothèse selon laquelle la diffusivité facilitée de la dopamine (et d’autres petites molécules) en raison de l’ECS altérée pourrait progressivement améliorer leurs propriétés de signalisation. Les méta-analyses démontrent une augmentation modeste de la libération de dopamine (et d’autres monoamines) en réponse à l’éthanol (38, 39). Il est peu probable que l’ampleur de l’augmentation de la dopamine explique les propriétés addictives de l’alcool chez certains utilisateurs. Il est intrigant de supposer qu’une combinaison synergique d’un renforçateur principalement faible avec une neurotransmission de volume progressivement augmentée en raison d’une diffusivité extracellulaire accrue pourrait comprendre un mécanisme auparavant non identifié pour expliquer l’effet addictif lent mais puissant de l’alcool. Le soutien de cette hypothèse attend une autre démonstration expérimentale.

Des implications mécanistes supplémentaires sont également possibles. Premièrement, les voies de transfert de fluide qui favorisent l’élimination des déchets et des métabolites à travers le système glymphatique pourraient être affectées (38). Récemment, un effet différentiel de l’alcool sur la clairance cérébrale a été trouvé chez des souris chroniquement injectées d’alcool, avec de faibles doses d’alcool augmentant et des niveaux moyens à élevés réduisant l’efficacité du système glymphatique (39). Cependant, ces effets sont largement dépendants de l’astroglie, et le principal effet observé ici concerne la microglie, dont l’importance pour la forme de l’ECS est bien établie (40). Deuxièmement, une partie de la fraction de microglie est également importante pour la plasticité structurelle, c’est-à-dire la taille et la formation des synapses et, finalement, l’apprentissage (40). La réduction du pool de microglies et du motif de ramification pourrait ainsi favoriser la formation de mémoires stables ou plus rigides. Ces effets peuvent interagir avec la plage de diffusion accrue rapportée ici et la neurotransmission de volume améliorée, qui ensemble peuvent entraîner une forme spécifique de plasticité fonctionnelle. Une augmentation de la concentration de neurotransmetteurs au fil du temps, par exemple de la dopamine, du glutamate ou des neuropeptides, associée à une réduction du renouvellement des synapses, peut interagir pour transformer les faibles propriétés gratifiantes de l’alcool en puissants effets de formation d’habitudes qui conduisent finalement à la dépendance chez certaines personnes. Comprendre et finalement inverser ces changements peut aider au développement d’interventions thérapeutiques plus efficaces.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Etude animale

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Instituto de Neurociencias de Alicante, Alicante, Espagne, et sont conformes aux réglementations espagnole (loi 32/2007) et européenne (directive UE 86/609, décret UE 2001-486 et recommandation de l’UE 2007/526 / CE).

Au total, 84 rats mâles msP ont été utilisés. La lignée a été créée par élevage sélectif pour une forte consommation volontaire d’alcool (6, 41). Les rats ont été importés dans les animaleries d’Alicante (expériences IRM, n = 36) et à Prague (expériences d’iontophorèse en temps réel, n = 12) de l’établissement d’élevage de l’École de pharmacie, Université de Camerino, Italie, à l’âge de 8 semaines. Les animaux pour l’étude d’immunohistochimie ont été préparés et directement exposés à l’alcool à Camerino. Rats were individually housed under controlled temperature (22° ± 2°C) and relative humidity (55 ± 10%) on a 12-hour light/12-hour dark cycle in transparent polycarbonate cages with bedding material. A wooden stick and nesting material were given as enrichment. All experiments were performed in accordance with Spanish (law 32/2007), Czech Republic (Animal Care Committee approval number 149/2010), and European regulations (EU directive 86/609 and EU decree 2001-486). Rats were given 30 days of access to two drinking bottles, one containing water and the other 10% (v/v) EtOH in water. Control rats were kept under same conditions but were given access to water only. Fluid consumption and animal weight were registered every 2 to 3 days, concomitant with replacement of the bottles’ content. After 1 month of two-bottle free-choice drinking regime, the EtOH-containing bottle was removed. For some experiments, rats were kept for another week without EtOH access. See Figs. 1 (A and B), 2A, and 3A for experimental designs.

Human study

The participants were 84 men enrolled in two different groups: (i) a cohort of 35 healthy controls and (ii) 49 treatment-seeking patients with AUD scanned at two time points (at 1 week after admission into the clinic and completion of detoxification treatment and after 2 to 3 weeks). The study was conducted at the Central Institute for Mental Health in Mannheim, Germany. The local ethics committee approved study procedures in accordance with the Declaration of Helsinki (42). Participants gave written consent and did not receive any stipend. Inclusion criteria and assessment are reported in the Supplementary Materials. Descriptive statistics of demographic data and clinical descriptors appear in Table 1.

MRI experiment

Human scanning was performed with a 3-T whole-body tomograph [MAGNETOM Trio with total imaging matrix technology; Siemens, Erlangen, Germany]. DTI data were acquired using an echo-planar imaging spin-echo diffusion sequence with the following parameters: repetition time (TR) = 14 ms, echo time (TE) = 84 ms, 41 gradient orientations uniformly distributed plus one nondiffusion weighted images, b value = 1000 s/mm2, matrix size = 128 × 128 × 64, and isotropic resolution of 2 mm3.

MRI experiments on rats were performed on a 7-T scanner (Bruker, Biospec 70/30, Ettlingen, Germany) using a receive-only phase array coil with integrated combiner and preamplifier in combination with an actively detuned transmit-only resonator. DTI data were acquired using an echo-planar imaging diffusion sequence, with 30 uniform distributed gradient directions, b = 670 s/mm2, four nondiffusion-weighted images, TR = 4000 ms, and TE = 23 ms. Fourteen horizontal slices were set up to field of view = 32 mm by 32 mm, matrix size = 128 × 128, in-plane resolution = 0.25 mm by 0.25 mm, and slice thickness = 1 mm.

MRI datasets were processed as follows: DTI data were corrected for motion and eddy current distortions, and local diffusion tensor was fitted using ExploreDTI (43). From the diffusion tensor components, MD maps were extracted. MD maps were nonlinearly registered to high-resolution human and rat MD templates (43, 44) using an advanced normalization approach (44). Voxel-wise comparisons were carried out to identify alcohol- and abstinence-induced differences. For the cross-sectional analysis, a general linear model was used within a voxel-wise, permutation-based, and nonparametric statistical framework (45) to test for significant differences controlling for age and multiple comparisons across clusters using threshold-free cluster enhancement. For the longitudinal design, the statistic was applied on the difference between time points. All statistical analysis was performed on the gray matter masks only. For both rats and humans, a gray matter segmentation was available in the template, and only voxels with a probability of >90% belonging to gray matter were used. Voxels containing cerebrospinal fluid (MD > 2 × 10−3 mm2/s) were also excluded from the statistics to avoid contamination.

In addition, for direct comparison with histological and real-time iontophoresis experiments, an ROI-wise analysis was also performed for the nucleus accumbens, caudate-putamen, cingulate cortex, hippocampus, insular cortex, and primary somatosensory cortex. In rats, ROIs were calculated using a study-based template, according to (6). To test for alcohol effect in AUD humans versus control, a one-way repeated-measures ANOVA was used with age as a covariate and group (AUD at first scan and healthy control) as the between-subject factor. Similarly, longitudinal differences in MD between AUD at first scan and 2 to 3 weeks after were tested using repeated-measures ANOVA, with time as the within-subject factor. Post hoc tests were corrected for multiple comparisons using false discovery rate.

To test the alcohol effect in msP rats, a two-way repeated-measures ANOVA was conducted. Time (baseline and 1 month of ethanol consumption) was defined as the within-subject factor and group (control and alcohol-exposed rats) as the between-subject factor. To test the effect of abstinence, one-way repeated-measures ANOVA was conducted. Conditions were naïve, EtOH consumption, and abstinence for each of the six ROIs. If the assumption of sphericity was violated, then degrees of freedom of the F distribution were Greenhouse-Geisser corrected. If required, then post hoc tests were adjusted by Tukey-Kramer corrections.

In vivo diffusion experiment with real-time iontophoresis

Animals were anesthetized with isoflurane (1.5% in a gas mixture of 35% O2/65% N2O) administered by a face mask, and their heads were fixed in a stereotaxic holder. Body temperature was maintained at 37°C with a heating pad. The somatosensory cortex was partially exposed by a burr hole of 1.5-mm caudal from bregma and 1.5-mm lateral from the midline, and the dura was carefully removed. The exposed brain tissue was bathed in warm (37°C) artificial cerebrospinal fluid containing 117 mM NaCl, 3 mM KCl, 35 mM NaHCO3, 1.25 mM Na2HPO4, 1.3 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2, 10 mM glucose, and 0.1 mM TMA+ (pH 7.4, 300 mOsM).

To determine the ECS diffusion parameters, that is, ECS volume fraction α (α = ECS/total tissue volume), tortuosity λ (λ2 = /ADC, where is the free diffusion coefficient, and ADC is the apparent diffusion coefficient in the brain tissue), and nonspecific uptake k′, we used the real-time iontophoretic method, developed by Nicholson and Phillips (dix). Briefly, an extracellular marker such as the tetramethylammonium ion (TMA+, Mw = 74.1 Da) is administered into the ECS by an iontophoretic pulse, and the local time-dependent changes in concentration of TMA+ are measured with a TMA+ ion-selective microelectrode (TMA+-ISM). TMA+-ISMs were prepared by a procedure described in detail previously (dix). Double-barreled TMA+-ISMs consisted of an ion-sensitive and a reference barrel, where the tip of the ion-sensitive one was filled with a liquid ion exchanger for K+ [Corning477317orIE190fromWorldPrecisionInstrumentsRRID:SCR_008593)thatishighlysensitivetoTMA[Corning477317orIE190fromWorldPrecisionInstrumentsRRID:SCR_008593)thatishighlysensitivetoTMA+ ions; the rest of the barrel was backfilled with 150 mM TMA+ chloride. The reference barrel contained 150 mM NaCl. The electrodes were calibrated using the fixed-interference method before each experiment in a series of solutions of 150 mM NaCl + 3 mM KCl, with the addition of the following concentrations of TMA chloride: 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, and 16 mM.

An electrode array was made by gluing a TMA+-ISM to an iontophoretic micropipette with a tip separation of 100 to 150 μm. Typical iontophoresis parameters were 20-nA bias current (continuously applied to maintain a constant transport number) and a +180-nA current step, with a 24-s duration to generate the diffusion curve. TMA+ diffusion curves were first recorded in 0.3% agar (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) dissolved in a solution of 150 mM NaCl, 3 mM KCl, and 1 mM TMACl, in which diffusion is free and by definition, α = 1, λ = 1, and k′ = 0. The diffusion curves obtained in agar were analyzed to yield the electrode transport number (n) and the free-TMA+ diffusion coefficient () by a nonlinear curve-fitting algorithm with a modified diffusion equation using the VOLTORO program (dix). Knowing n et , the values of α, λ, and k′ can be obtained from the diffusion curves when the measurement is repeated in the tissue.

Diffusion measurements were performed in the mediolateral axis in depths of 400 to 2000 μm from the surface, in 200-μm intervals. The cortex is optimal because the chances that the pipette gets obstructed are much smaller compared to deeper brain structures, resulting in more robust measurements. Three diffusion curves were acquired in each depth, and the yielded values of the ECS diffusion parameters were averaged to obtain a representative value for the specific depth. The values of α and λ for an individual cortical layer were then calculated from the data obtained in the appropriate depths: 400 and 600 μm, layer III; 800 μm, layer IV; 1000, 1200, and 1400 μm, layer V; 1600 and1800 μm, layer VI; and 2000 μm, white matter (42, 43). Statistical comparisons were performed as above using two-way ANOVA with group (control and EtOH exposed) and cortical layer (III to VI) as factors. As no interlayer statistical differences were found either for α or λ values, the data obtained in the individual layers were pooled.

Immunohistochemistry

The brains were fixed (24 hours) in buffered 4% paraformaldehyde (pH 7.4) and then stepwise saturated with sucrose (10, 20, and 30%) for cryoprotection. After freezing, 40-μm serial coronal sections were cut on a freezing sliding microtome (HM550, Microm International GmbH, Waldorf, Germany). The slices were first incubated in blocking solution, which contained 5% ChemiBLOCKER (Millipore, MA) and 0.2% Triton X-100 in 0.01 M phosphate-buffered saline. This blocking solution was also used as the diluent for the antisera. The slices were then incubated with the primary antibodies at 4°C overnight. As primary antibodies, we used mouse anti-GFAP antibody conjugated with Cyanine 3 (Cy3) (Sigma-Aldrich, catalog no. C9205), mouse anti–chondroitin sulfate antibody CS-56 (Abcam, catalog no. ab11570), and mouse anti–Iba-1/apoptosis-inducing factor 1 antibody (Merck Millipore, catalog no. MABN92). Along with the unconjugated antibodies, secondary anti-mouse immunoglobulin M (IgM) Cy3 (Merck Millipore, catalog no. AP128C; used for CS-56 staining) or goat anti-mouse IgG antibodies conjugated with molecular probe Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, catalog no. A11029; used for Iba-1 staining) were applied for 2 hours. Slices were mounted using a Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, catalog no. H-1000).

The tissue sections were then examined using an LSM 5 DUO spectral confocal microscope equipped with 40× oil objective (Carl Zeiss AG, Germany). Evaluation of differences among the animal groups in GFAP- and Iba-1–positive cell numbers, astrocyte morphology, expression of CSPG, and Iba-1 expression was performed in the somatosensory cortex (lamina V), cingulum, hippocampus (dentate gyrus), insular cortex, caudate-putamen, and nucleus accumbens. To quantify the morphological differences, the slices were scanned using the fixed setup conditions and laser power. Median signal intensity in arbitrary units was evaluated by LSM 5 Image Browser (Carl Zeiss AG, Germany; LSM Image Examiner) in each section (in both Iba-1– and CSPG-stained slices). Analysis of Iba-1– and GFAP-positive cells was performed using a Fiji image-processing package (46), a modification of ImageJ software. Morphological three-dimensional analysis and reconstruction of Iba-1–positive cells were performed using IMARIS software (Bitplane). Dendritic density refers to the normalization and comparison of dendrites’ amount in space among different kinds/conditions of cells, taking into account all kinds of branching processes within the cell with the following equation: [sum of the terminal orders + number of terminals] × [total dendritic length/number of primary dendrites]. Statistical comparisons were performed using two-way ANOVA with group (control and EtOH exposed) and ROIs (nucleus accumbens, caudate-putamen, cingulate cortex, hippocampus, insular cortex, and primary somatosensory cortex) as factors, and unpaired t test with group (control and EtOH exposed) in the case of morphological analysis for nucleus accumbens and hippocampus.

Microglia depletion and activation

Microglia depletion was achieved by administering the CSF1R inhibitor PLX5622 (Plexxikon Inc.) to n = 7 rats in two ways: as a dietary supplement in standard chow at 1200 parts per million (Research Diets) and with intraperitoneal injection of 50 mg/kg in vehicle once a day. n = 4 control rats were given the same chow without enrichment and were injected intraperitoneally once a day with the same doses of vehicle. After 7 days, the rats underwent DTI and histology according to the protocols previously described.

Microglia activation was achieved in n = 7 rats by intracranial injection in the dorsal hippocampus (coordinates bregma of −3.8 mm, dorso-ventral of 3.0 mm, and 2 mm from midline in the left hemisphere) of 2 μl of saline and LPS at a concentration of 2.5 μg/μl. The opposite hemisphere was injected with saline. Because structures too close to the craniotomized skull will contain artefacts in the MRI data, producing poor measurements quality, we selected the hippocampus, which is far enough from the surface. After 24 hours from the LPS injection, the rats were scanned using a DTI protocol and perfused for histology, as previously described.

Numerical solutions to the diffusion equation for dopamine

The diffusion equation incorporating uptake, characterized by a Vm, and a Michaelis-Menten constant (Km), was transformed to an integral equation and solved numerically for the dopamine concentration C, according to the method reported by Nicholson (17) using the software Mathematica v10 (Wolfram, Champaign, IL). Two different substrates were generated, according to the ECS volume fraction α and tortuosity λ measured by real-time iontophoresis: control and EtOH. Control substrate had α =0.20 and λ =1.54, while EtOH substrate had α = 0.19 and λ =1.39 (see real-time iontophoresis results). The value for the free-diffusion coefficient of dopamine was assumed to be free = 6.9 10−6 cm2/s, the duration of the dopamine release from the source was 1 s, the radius of the source was 2 μm, the source current was 100 nA, Km was 0.15 μM, and Vm was 0.2 μM/s. To mimic the two dopamine fire modalities (tonic or phasic), we used two different current regimes: flat and burst. In the first one, the current was constant during the 1-s period; in the second regime, the current was on in bursts of 4 ms each, with a frequency of 20 Hz (47). The equation was solved in the grid R = 0 to 100 μm and T = 0 to 3 s using the function NDsolveValue with the following parameters: MaxSteps, 4,000,000; MaxStepFraction, 1/20; StartingStepSize, 1 × 10−11; AccuracyGoal, 20; and PrecisionGoal, 10. Regarding the numerical approach, solving the differential equation describing dopamine diffusion and uptake in the ECS requires a finite-difference method and is thus subject to round off and truncation errors. To make these errors comparable for the two cases of interest (alcohol and control), the boundary conditions have been chosen according to each effective diffusion coefficient, defined as the dopamine diffusion coefficient divided by the squared tortuosity.

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution license, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

REFERENCES AND NOTES

  1. E. Syková, Ionic and Volume Changes in the Microenvironment of Nerve and Receptor Cells (Berlin, Heidelberg, New York, Springer-Verlag, 1992).

  2. K. Fuxe, L. F. Agnati, Volume Transmission in the Brain (Raven Press, New York, 1991).

  3. A. Leemans, B. Jeurissen, J. Sijbers, D. K. Jones, ExploreDTI: A graphical toolbox for processing, analyzing, and visualizing diffusion MR data, in 17th annual meeting of International Society for Magnetic Resonance in Medicine (Berkeley, CA, USA, 2009).

Acknowledgments: We thank B. Fernández for excellent technical assistance and S. J. Ballestero for the schematic representations in fig. S5. Le financement: This work was supported by the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program (668863-SyBil-AA) and the ERA-NET NEURON program (FKZ 01EW1112-TRANSALC and PIM2010ERN-00679), as well as the Spanish State Research Agency through the Severo Ochoa Program for Centres of Excellence in R&D (SEV- 2017-0723), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (center grant TRR265-B08), and the Czech Science Foundation (GACR; grant no. 16-10214S to L.V.). S.C. and D.M. further acknowledge financial support from the Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) and FEDER funds under grant nos. BFU2015-64380-C2-1-R, BFU2015-64380-C2-2-R, and PGC2018-101055-B-I00 and the Generalitat Valenciana through the Prometeo Program (PROMETEO/2019/015). S.C. also acknowledges support of the Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad (#2017I065). E.S. acknowledges financial support from the Slovak Research and Development Agency (APVV-17-0642). S.D.S. is supported by a NARSAD Young Investigator Grant (grant no. 25104), by the European Research Council through a Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (grant no. 749506), and by the Generalitat Valenciana grant SEJI/2019/038. R.C. is supported by the NIAAA grant AA017447. W.H.S acknowledges support from the Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; FKZ: 031L0190A, 01ZX1909CA). Author contributions: Conceptualization: D.M., W.H.S., and S.C.; data curation: S.D.S., A.C.-L., R.G.-H., and P.B.; formal analysis: S.D.S., A.C.-L., R.G.-H., P.B., L.V., and I.V.; investigation: S.D.S., A.C.-L., R.G.-H., P.B., L.D., I.V., and S.S.; methodology: S.D.S., A.C.-L., E.S., L.V., R.C., D.M., W.H.S., and S.C.; project administration: W.H.S. and S.C.; resources: S.S., R.C., P.K., and F.K.; software: S.D.S.; supervision: W.H.S. and S.C.; validation: W.H.S. and S.C.; visualization: S.D.S. and R.G.-H.; manuscript writing: S.D.S., W.H.S., and S.C.; manuscript editing: S.D.S., P.B., L.V., E.S., D.M., W.H.S., and S.C. Intérêts concurrents: Les auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêts concurrents. Data and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data are available from authors upon request.

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